生化药物发展概况与基因工程药物质量标准的若干内容及方法李海生，覃婷婷(天津市药品检验所，天津)摘要概括介绍了生化药物的发展过程，为解决标准制订中的有关问题，结合所完成的实验实例介绍了方法的设计、应用与注意事项。关奠词生化药物，基因药物，标准制订中图分类号：R92文献标识码：A文章编号：1006—5687(2005)05—0048—061生化药物发展概况迄今为止，生化药物按照其产品纯度、工艺特点和临床疗效大体经历了三个发展阶段，一些利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物质与其他共存成分相混合的制剂于20世纪50～70年代相继问世，例如利用牛、羊胆酸与胆红素等制成的人工牛黄，利用牛羊新鲜眼球制成的眼明注射液、滴眼液(现国家标准更名为眼氨肽注射液、滴眼液)，利用胎盘生产的胎盘注射液及胎盘片，利用猪肠黏膜生产的肝素钙和肠多糖，利用动物的喉骨或软骨组织生产的硫酸软骨素，利用银耳生产的银耳口服液等。上述药物约有数十个品种。由于疗效尚可，加之质量标准的不断提高，因此，在现行国家级药品标准中仍占有一席之地。第二代生化药物是根据生物化学和免疫学原理，应用近代生化分离、提纯技术，从生物体中提取的具有针对性治疗作用的生化成分，例如从猪胰脏中提取的猪胰岛素(insulin)，从男性尿中提取出的尿激酶(urokinase)，从孕妇尿中提取的绒毛膜促性腺激素(chorionic gonadotrophin)，从猪胰脏中提取的胰激肽原酶(pancreatic kininogenase)，从香菇中提取的香菇多糖(1entinan)等。这类药品的特点是纯度较高，疗效确切，质量标准的可控性强。故该类药物仍有一定的发展空间。第三代药物是指利用基因重组等技术生产的药}收稿日期：2005—06—20李海生．男(1955一)，主任药师，专业方向：生化药品与天然产物标准制订与检验。天津药学TianjinPharmacy2005年10月第17卷第5期物，如人胰岛素(human insulin)、a一干扰素(a—interfer— on)、白介素一2(interleukin一2)等数百个品种。第三代生化药品生产的最大特点是不像第一、二代生化药品生产中受原材料资源的影响而是在发酵罐或培养液中进行。上述技术将成为今后生物药品开发与生产的主流方向，根据全球权威医药市场咨询调研公司IMS最新的统计表明，2004年基因重组生物技术药物的年销售额已经突破400亿美元，从1998年至2003年全球生物技术药物年销售额增长率在15％～33％，远高于年增长率为7％～10 oA的传统制药业。2国内外的基本情况}匕较¨】生物制药产业虽然起点大致相同，但伴随着综合国力的较量，发展出现了不平衡。1993年，北美(主要是美国)、欧盟和日本的生物制药产业几乎是三足鼎立，在总共84亿美元的市场份额中各占20亿～30亿美元。但经过10年的发展，美国远远把其他国家和地区甩在后面。截至2002年底，美国生物技术药物销售额占全球市场的58％，并且这个比例还有扩大的趋势。而欧盟经过最近5年的发展，其市场份额达到22％。日本的生物制药发展相对滞后乃至停滞，近10年来，生物技术药物的销售额一直徘徊在20～30亿美元，其生物制品的种类和生产规模远不及美国。尤其是发展迅猛的抗体类药物，日本的研发力也非常有限，到2001年只有一种治疗性抗体(OK—T3)上市。不过最近两年日本已意识到在生物制药领域的差距，政府和公司都在加强生物制药领域的投人，仅2001—2003年就批准了5种治疗性单克隆抗体，它们分别是Her— ceptin、Rituxan、Stimulect、Remicade和Synagis。其他国家和地区生物制药基本上处于起步阶段。我国目前具有一定基础和实力的生物制品企业有北京凯因生物技术、哈药集团生物工程、天津华立达生物工程、安徽安科生物工程、沈阳三生、北京远策药业、深圳海王英特龙生物技术、长春生物制品研究所、上海华新生物高科技、上海万兴生物制药等20余家。存在的问题是完全属于自我创新的技术很少。据有关资料显示，2000年9月一2004年9月，我国共有108个批准文号的生物制品进行了补充申请，但涉及的主要品种只有重组人干扰素、重组人红细胞生成素、重组人粒细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素、重组人生长激素等数种。申报新药临床研究的有175个，涉及的主要品种只有流行性感冒病毒裂解疫苗、注射用重组瑞替普酶(TPA)、重组人干扰素j3—1b等几个。拿到申请新药证书及生产批件的有230个，但包含的主要品种只有人神经生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人白介素一11、重组人白细胞介素一2和重组人肿瘤坏死因子一NC等几种。生物制品研发尚未走出仿制的阴影。与发达国家相比，我国生物技术的实验室技术水平差别不大，但在产业化方面的差距正在逐渐加大：当世界有20多种畅销生物药时，我国能生产10种；现在世界上已有140多种生物药，我国却只能生产十几种。缺乏总体布局，重复性仿制是影响我国生物制药进一步发展的主要问题之一。以a一2b干扰素为例，自1996年哈药集团生物工程公司开发的冻干针剂获准上市后，目前国内已有20家企业拥有40多个批文，能生产约10种重组a一2b干扰素剂型，导致产品过剩。上述情况实际上是中药、化学制药领域低水平重复的翻版。如何协调和解决好上述问题是国家和企业应该立即着手解决的问题。3基因工程药物质量标准的制订内容及方法心’33生物技术特别是基因重组技术的成功给生物药品的开发与生产带来了革命性变化，并继续活跃在科学技术发展的前沿。但是若将开发出的产品作为药物提供给临床，其质量、有效性和安全性的评价是不可缺少的环节。一个好的质量标准，应该能真实地反应出该药品的安全性与有效性，并能通过该标准实施合理的质量管理。每个标准由若干个项目组成，具体项目的设置应根据各自的生产工艺、产品特点等有所不同或侧重。此外，针对生物药品检测技术的难度大多高于化学合成药物，原因是在作鉴别及纯度实验时，要分析和区别的对象常常是高分子蛋白中一个或几个氨基酸发生置换的衍生物，以及发生了微小变化的高分子蛋白质，下面结合不同的实例就主要项目加以介绍。3．1鉴别只设置对主成分的鉴别或包括对主成分和主要赋形剂的鉴别，但以后者方式为多。例如用于治疗肿瘤的药物注射用索马杜林(somatuline)缓释制剂，规定了对主成分的鉴别(HPLC法)，同时又规定了对缓释剂聚乙丙交酯共聚物的鉴别(IR法)及冻干添加剂甘露醇的鉴别(TLC法)等。不少生物药品在鉴别中利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳技术，即供试品中主成分的泳动距离应与对照品一致。3．2检查3．2．1有关物质的检查亦称为纯度检查，基本采用理化学的分析方法。例如治疗骨质疏松的基因药物El— catonin标准中采用HPLC及自身对照方法检查有关物质，并规定不得超过1％；人胰岛素采用GPC(凝胶色谱法)做聚合体检查，有些企标采用HPI。C柱后衍生法用于尿激酶中高分子量尿激酶及其降解后产生的低分子量部分的检查等。值得指出的是PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)法的应用价值，该方法系利用蛋白表面电50天津药学TianjinPharmacy2005年10月第17卷第5期荷不同而分离。不少应用结果表明：有一些用SDS—PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳)呈单一谱带的物质用PAGE可分离出多条谱带。例如蛋白质的脱胺体，用PAGE可将二者分离，而SDS—PAGE则不能识别，SDS—PAGE主要用于分子量的确定与检查。另外，等电聚焦(IEF)利用蛋白质的等电点不同而使之分离，主要用于测定等电点，也适用于纯度检查。IEF可识别出高分子蛋白中只有1个氨基酸残基不同的物质，例如可分离Met—IL一2(PI7．5)和IL一2(PI7．7)，亦可分离IL～I?(PI6．8)和Met—IL—p(PI6．9)。IEF还可分离电荷异构体(chargc isomer)，如基因重组的金属蛋白质SOD。3．2．2肽谱分析肽图谱分析是基因工程多肽药物质量控制的重要手段之一。肽图谱对每一种蛋白质来说是特征和专一的。因此可用于检查各批产品蛋白质一级结构的一致性。目前多以RP—HPLC分离并测定，肽切酶有胰蛋白酶(Arg—X、Lys—X)、胰凝乳蛋白酶(Y—X：Y—Tyr、Phe、Try、Met)、蛋白内切酶(Lys—C、Lys—X)、金属内切酶(x—Lys)、蛋白内切酶(Arg—C、Arg—X)、蛋白酶VS(Glu—X、Asp—X)可供选择，例如不同基源的胰岛素(人、猪、牛)，结构上只有1或2个氨基酸残基不同，但其肽图谱有着明显差异。笔者测定了造血因子之一的颗粒球巨型细胞集团刺激因子(G—CSF)肽图谱，具体测定方法如下。3．2．2．1色谱条件十八烷基硅烷键合硅胶(4．6 mm×150 mm，5肚m)，检测波长214 nm，柱温25 oC，流动相A为稀三氟乙酸溶液(1—1000)，流动相B为乙腈一1％三氟乙酸溶液(90：10)，按以下方式梯度洗脱，流速约l ml／min(必要时需调整流速使肽谱中最后一对峰面积的保留时间约为48 min)。3．2．2．2梯度洗脱条件见表1。表1梯度洗脱条件3．2．2．3系统适用性条件取对照品溶液200 pI注人液相色谱仪，第1、1I、Ⅲ对峰的保留时间约分别为24、27和35 rain。3．2．2．4供试品和对照品溶液的制备分别取供试品和对照品溶液(2 mg／m1)50弘l，加入胰蛋白酶消化用缓冲液50弘l，胰蛋白酶溶液(1—1000)4 pl混合，在37 oC酶解18 h后，加入8 mol／L盐酸胍溶液0．125 ml，充分混合，加入二硫苏糖醇溶液(771—5000)10 pl，混合，在水浴中加热1 rain后，放至室温，取200 pl注入液相色谱仪，供试品峰的保留时间与峰形应与对照品峰相同。3．2．3细胞由来的蛋白质在基因工程药物颗粒球巨型细胞集团刺激因子(G—CSF)标准中，规定检查表达细胞——大肠杆菌由来的蛋白质。由于其含量很低，故多用于ELISA法。以大肠菌蛋白质作对照品，并规定其含量应在0．04％以下。笔者测定了Sandoz公司的三批产品，其残余蛋白质比限度规定低1个数量级。3．2．3．1供试品溶液的制备取本品适量，用聚山梨醇酯20的pH7．0的0．01 mol／L磷酸盐等渗缓冲液(1—4000)，准确稀释至0．25 mg／ml的溶液。另取大肠菌由来的蛋白质按其标示量，用上述等渗缓冲液制成0．16．g／ml的溶液作为标准品溶液。3．2．3．2测定法在透明的聚乙烯制的96穴板的各穴中准确加入一次抗体溶液100肚l，4 oC放置16～24 h，除去抗体溶液，在各穴中加满聚山梨醇酯20的pH7．0的0．01 mol／L磷酸盐等渗缓冲液(1—2000)，放置约3 min后除去(洗净操作)。再反复洗净操作2次，以8行×12列方式放置，第1列作为空白区域，第2、3列作为工作曲线区域，第4列以下作为供试品区域。自工作曲线区域第2至第8穴位和供试品区域第2至第4以及自第6至第8穴位各分别加入上述等渗缓冲液(1—4000)100肛l，然后自2、3行的第1穴位各准确加入标准溶液0．2 ml，混匀，自各穴中准确吸取100肛l，加入到下一个穴位中，反复操作至第8穴位。然后自第4～12行的第1穴位中准确加入供试品溶液0．2 ml(可做两份平行)，以下按标准品溶液的倍数稀释法操作至第4行，在370C保温3 h后，弃去溶液，反复清洗3次，在各穴位中准确加入二次抗体100 pl，在37 oC放置2 h后，反复清洗3次，然后准确加入酶反应液100 pl，在室温准确放置10 rain，立即准确加入稀硫酸(1—9)100弘l，混合，在492 nrn波长处测定吸光度，求出两份结果的平均值，并扣除空白的吸收值。以吸光度为纵坐标，蛋白质含量(mg)为横坐标作图，并按下述公式计算出含量。F。；大肠菌由来的蛋白质(％)一篙X100％ULIExi：从工作曲线中读取的蛋白质量(rag)Gci：读取Txi穴位中GM—CSF量(rag)3．2．4分子量的测定分子量的测定多采用SDS—PAGE电泳法。具体的质量标准制订可参照两种方法。天津药学TianjinPharmacy2005年10月第17卷第5期第一种：规定供试品与对照品的泳动距离一致。第二种：除上述规定外，在同时用适宜组合的蛋白质对照品制备工作曲线并计算出供试品的分子量。现以GM—CSF分子量测定为例具体介绍操作的方法。3．2．4．1供试品溶液的制备取本品适量，用水一pH6．8的0．5 mol／LTris缓冲液一甘氨酸一十二烷基硫酸钠溶液(1—10)一溴酚蓝溶液(1—2000)一二巯基乙醇混合溶液(47：10：10：10：2：1)稀释至每1 ml中含GM—CSF对照品适量，用上述混合溶液溶解并稀释制成50 tag／ml的溶液，在水浴中加热约2 min，作为标准品溶液。取样品和对照品溶液各50弘1做SDS—PAGE。3．2．4．2平板胶的制备①玻璃板长和宽均应在5 cm以上．板间距应为0．75～2 mm。②分离胶取双丙烯酰胺溶液(约14％)21 rnl，pH8．8的1．5 mol／LTris缓冲液11．3 ml，十二烷基硫酸钠溶液(1—10)0．45 ml和水13．2 mj，混合脱气后加过硫酸铵溶液(1—10)5弘l和N，N，N’，N’一四甲基二乙烯基二胺12 pl，立即注入制胶板层中，上面加适量的水后，放置16～24 h。③浓缩胶除去分离胶上的水后，插入样品梳。取双丙烯酰胺溶液(约5％)3．3 ml，pH6．8的0．5 mol／LTris缓冲液5．0 ml，十二烷基硫酸钠溶液(1—10)0．2 ml和水11．3 ml，混合脱气后加过硫酸铵溶液(1—10)0．1 ml和N，N，N’，N’一四甲基二乙烯基二胺10弘1。立即注入分离胶上面，放置45 min使之胶化后，取出样品梳。3．2．4．3电泳开始时电流按每cm2胶面积约18mA设定。待样品溶液中溴酚蓝谱带到达分离胶上端时将电泳调升为每cm2胶面积约25 mA，继续电泳至溴酚蓝谱带距胶的下端约lcm，停止电泳，取出胶板后，染色。3．2．4．4染色将上述胶板浸去甲醇一水一冰醋酸混合溶液(5：4：1)200 ml中，平稳振摇条件下至室温放置16～24 h，浸去0．2％的考马斯亮蓝一R一250的水一甲醇一冰醋酸溶液(14：5：2)中，平稳振摇条件下至室温放置2 h以上，取出，浸去水一甲醇一冰醋酸溶液(14：5：2)200 ml中，必要时可更换上述溶液，至蓝色谱带清晰地显示。供试品与对照品的分子量的测定值一般在±5％范围内即符合规定。3．2．5 pH值、水分根据三批以上批量生产的供试品的pH值，并重点参考稳定性试验、加速试验和长期试验研究数据，制订出合理的pH值范围，在该pH值范围内应能保证产品的含量及有关物质等项目符合质量标准的规定。水分检测主要指对冻干制剂的要求，目前国际上公认的标准为不超过3．0％，所用的方法有费休氏法和减压干燥失重测定法。减压干燥时除另有规定外，压力应在2．67 kPa(20 mmHg)以下，对大多数减压干燥箱而言，指针达到其反方向的最低刻度处，即约为2．67 kPa。3．2．6异常毒性主要检查目标产物以外的有毒物质，方法可按《中国药典)年版三部的规定执行。常用小鼠或豚鼠，注射量一般要求按WHO关于生物制品的注射量即小鼠1 ml和豚鼠5 ml进行。由于产品本身具有较强的生物活性，故应注意考察给药途径，如腹腔注射或尾静脉注射对异常毒性检验结果的影响，必要时可对项目的设置做出必要的调整或替代。3．2．7无菌注射用制品按《中国药典7年版三部有关规定进行无菌试验，应符合规定。3．2．8热原可参照《中国药典7年版三部有关规定进行热原试验。一般采用家兔法，每只家兔耳静脉注射人用最大量的3倍量，共3只，静脉注射判定标准为每只体温升高不得超过0．6 oC，3只总和不得超过1．6 oC。对于具有很高生物活性的产品，如细胞因子类，由于本身具有致热作用，故可考虑采用细菌内毒素检查法替代。也有国外进口产品，如基因重组白细胞介素Ⅱ(rhIL一Ⅱ)采用注射人用剂量的1倍量进行家兔热原试验。3．3含量或活性测定生物药品过去多采用以动物试验方法测定其活性，例如以小鼠惊厥法测定胰岛素的含量，以动物试验法测定缓释制剂的释放速率等。现在逐渐以仪器分析技术或体外细胞培养的方法替代(而非取代)动物试验方法。例如目前在全球范围内胰岛素和人生长激素的含量测定已采用HPLC法，以体外释放装置和技术测定兰瑞肽的缓释速率“1等。仪器分析技术替代生物测定法的最大量的工作主要是证明两种方法测定结果的相关性。例如将样品经适当的酸、碱、氧化、光照、强力振荡、高温破坏及长期放置后再分别予以测定等，由于仪器分析技术已熟练的被采用，故本文不再展开讨论。现列举几个应用实例或方法供参考。3．3．1香菇多糖的抗肿瘤活性测定实验动物为ICR系20日鼠，体重约25 g，10只为一组，在其腰部皮下注入继代移植(移植第7d)的腹水型瘤细胞3×105个。次日，给各实验动物腹腔注射香菇多糖溶液0．1 ml(o．25 mg／m1)，1次／d，连续5 d，从第7 d开始再继续注射给药5 d，以此方法连续给药5周，解剖后取出肿瘤测定重量。对照组用蒸馏水。按下列公式计算肿瘤抑制率。按要求，肿瘤抑制率应在80％以上。肿瘤抑制率(％)一—WiC-矛W_T×100％肿瘤抑制率(％)一—i矛一×％52天津药学TianjinPharmacy2005年lo月第17卷第5期式中WC为对照组肿瘤平均重量，WT为给药组肿瘤平均重量3．3．2颗粒球巨型细胞集团刺激因子的细胞活性测定方法3．3．2．1供试品溶液的制备取本品及标准品适量，用试验用培养介质准确稀释成每1 ml中含0．02～o．1 pg的溶液，取样品和标准溶液各50 pl，按下述方法测定对细胞(AMI．一193)的增殖活性。3．3．2．2细胞浮游液的制备在增殖培养介质中增殖，离心富集并用试验用介质调制成每lml中含10×104～30×104个细胞。3．3．2．3测定法多孔板(96孑L)以横向方式使用。在各孔中分别加入培养介质50肛l，在2、3、4行的第1列孔中分别加入样品溶液50弘1，在5、6、7行的第1列中加入标准溶液各50 pl，充分混和后，从各孑L中准确量取50 pl，注入到下一孑L中，一次反复操作至第11列，12列孔作空白区。然后分别加入细胞浮游液各50 pl，置C0：培养装置(6％c02)于37。C培养6 d，培养后在各孔中分别加入pH7．6的MTT磷酸盐等张力溶液(1—200)10肛l，继续在CO。培养装置中培养4 h后，以650～700 nm的某波长作为参比波长，以540～570 nm的某波长测定吸光度。减去空白区域的平均值作为校正吸光度，求出样品溶液和标准溶液的校正吸收度(，z一3)并以列编号作图，求出标准溶液第2列和第3列吸光度平均值的50％的值，利用该值的点分别求出供试品和标准品溶液在横坐标上的列数值为Dt和Ds，按下式计算细胞增殖活性。细胞增殖活性(U／m1)一A×B×C×2队_1“A：标准品的比活性(U／mg)B：1 m1标准品溶液中含GM—CSF量(mg)C：样品溶液的稀释容量比3．3．3低抗凝肝素钠原料的抗Xa因子活性测定方法3．3．3．1标准品储备液的制备精密称取低分子量肝素钠标准品适量，按标示效价加氯化钠溶液溶解成含抗Xa因子10U／ml的溶液。3．3．3．2标准品溶液的制备试验当H，精密量取标准品储备液适量，以三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7．4)(取三羟甲基氨基甲烷6．08 g，氯化钠8．77 g，加水500 ml使溶解，再加牛血清白蛋白10 g，溶解后，用1 mol／L的盐酸溶液调节pH至7．4，加水稀释至1000 m1)分别稀释制成抗Xa因子0．025、0．05、0．10和0．20U／ml的四种浓度的溶液，作为标准品溶液。3．3．3．3供试品溶液的制备精密称取适量(约相当于抗Xa因子1 oOOU)，置100 ml量瓶中，加氯化钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 ml，置100 ml量瓶中，加三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7．4)稀释至刻度，制成约含抗Xa因子0．1U／ml的溶液。3．3．3．4测定法精密量取四种浓度的标准品溶液和供试品溶液各50弘l，分别置于1．2 cm×7．5 cm的小试管中，每管加抗凝血酶Ⅲ溶液[用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7．4)稀释制成5U／ml的溶液，临用新配]50肛l，摇匀，于(37±0．5)oC水浴中准确保温1 min，加入牛Xa因子溶液[用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7．4)稀释制成5U／ml的溶液，临用新配]100 pl，摇匀，于(37土0．5)oC水浴中准确保温1 min，加入生色底物R。溶液[取生色底物R，，用水制成3×10卅 mol／L的溶液，临用时，用三羟甲基氨基甲烷一乙二胺四醋酸二钠缓冲液(取氯化钠5．12 g，三羟甲基氨基甲烷3．03 g，乙二胺四醋酸二钠缓冲液1．4 g，加水250 ml，用1 mol／L盐酸溶液调至pH8．4，加水稀释至500 m1)稀释成5×10卅rnol／L的溶液，临用新配]250肛l，于(37．o土0．5)oC水浴中准确保温4 min，立即加入冰醋酸380弘l，摇匀，照分光光度法《中国药典))2000年版二部附录ⅣB，在405 nm的波长处，以用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7．4)为空白，分别测定吸收度，以标准品溶液单位的对数值为横坐标，以吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。根据供试品溶液的吸收度在标准曲线上求出其效价。3．3．4糖蛋白中糖含量的测定糖蛋白中糖的存在，对保持其活性和稳定性是很重要的，可在标准中考虑设置糖含量的检查。糖链的水解方法可用2．5 mol／L三氟乙酸，在减压下100 oC水解6～7 h(对于中性糖和氨基己糖)；0．1 mol／L硫酸800C水解1 h(对于唾液酸)；0．01 tool／L盐酸80～90。C水解1 h(对于唾液酸)；甲醇分解法(对于中性糖+氨基己糖+唾液酸)。测定方法对中性糖可选用苯酚一硫酸法和苔黑酚一硫酸法，氨基己糖可用对二甲氨基苯甲酸法，唾液酸可用高碘酸法等。另外，上述糖类均可衍生后以GC或HPLC分离分析，这也是较理想的方法[5]。3．3．5蛋白质的含量测定在质量标准中设定此项目主要用于原液比活性计算等。目前实际应用最多的是劳力氏(Lowry)法[6]，也称之为福林一酚试剂法，其灵敏度比双缩脲法高约100倍，比紫外吸收法高约10～20倍，是蛋白质量化的较可靠方法，具体操作可按照《中国药典))2005年版三部(附录VI第二法)的规定。在实际测定中应注意以下几方面问题，①赋形剂的干扰问题，例如规格为1 mg的冻干人转移因子中含有作为支撑剂的甘露醇，其浓度约为5 mg／ml，若不做空白校正测得的蛋白质含量比实际含量高约50％[7]。②福林天津药学TianjinPharmacy2005年10月第17卷第5期～酚试剂仅在酸性条件下稳定，但显色反应是在pH10条件下进行，应注意当酚试剂加到碱性的铜一蛋白质溶液中时，必须立即混合，使得在磷钼酸一磷钨酸试剂破环之前发生还原反应。③供试品的浓度问题，不同标准中规定的反应浓度有所不同，范围从60～120／lg。实验数据表明当供试品浓度为60 pg时，显色后吸收值为0．23～0．24，应注意适当调整供试品浓度，使显色后的吸收值在0．3～o．7之间以减少实验误差[8j。参考文献1胡文华．生物制药，船多当心障江行．中国医药报，2005—06—28(B5)．版2王军志主编．生物技术药物研究技术和质量控制．北京：科学出版社，2002．853陈执中，章月华编著．现代生化药物与基因工程药物分析．上海医药大学出版社，2003．814黄哲，李华龙，李海生．介绍一种用于生物药品体外释放测定装置及方法设计．药物分析杂志，1999，19(S)：1255TaKaoHAYAKAWA．Method for determ—ining the structural of carbohydrate moieties of glycoprotein drugs．IyakuhinKenk—YU，1989，20(4)：7356LowryOH，RosebroughNJ，FarrAL，et a1．Protein measure— ment with tM folin phenol reagent．JBiolChem．，1951，193：2657张修建，稽扬，王亚南，等．甘露醇对Lowry法测定生化药的蛋白质含量的影响．药物分析杂志。1999，19(s)：1428张莉，李海生．劳力氏法测定蛋白质肽类含量的最佳样品量的考察．天津药学，2000，12(2)：74