Tim基因家族(T cell immunoglobulin and mucindomain containing molecules gene family)是一个通过编码免疫球蛋白和粘蛋白分子而在Th1、Th2 细胞表面区别表达的一个基因家族,在机体过敏和肿瘤免疫等疾病中发挥着重要作用[1-5]。

小鼠的Tim基因家族有8 个成员,Tim4 与人的基因高度相似,但只能表达在APC 表面,在人体中Tim4 却可以表达于活化的CD4+T 和CD8+T[6-7]。在小鼠中敲入人源化的Tim4 基因能够更好的研究T 淋巴细胞的调节作用,以及与Tim4 关联密切的哮喘等免疫疾病[8]。

对免疫功能和免疫疾病表现通常伴有血象变化,转基因后的hTIM4-EGFP模型鼠与野生型是否存在差异,以及后期应用于感染实验的血象变化是否来自于基因编辑或是免疫反应,都需要进行血液生理生化指标的前期测定,从而为其应用提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

转基因组hTIM4-EGFP与对照组野生型C57BL/6 各18 只,分别有雌性8 只、雄性10 只,SPF级,体重25～30 g,均来自本单位实验动物资源研究所[SCXK(京) 2017-0005]。 利用自行建立的CRISPR/Cas9 技术将hTIM4 基因定点敲入野生型C57BL/6 小鼠,胚胎注射、转录等操作均在屏障环境中完成[SYXK(京)2017-0013],PCR 检测阳性即为阳性转基因鼠。 转基因组与对照组均饲养于屏障环境[SYXK(京)2017-0013]。

满12 周龄的两组小鼠,空腹12 h 后,采20 μL眼静脉抗凝血加入稀释液中用于测定血液生理指标,取全血分离血清,用于测定血清生化指标。 饲养和实验操作均按照实验动物福利伦理3R 原则规程进行,并经中国食品药品检定研究院实验动物福利伦理审查委员会审批(中检动(福)第(B)021号)。

1.2 主要试剂与仪器

清洗液与溶血剂购自上海东湖生物医学有限公司;碱性磷酸酶等生化检测试剂购自中生北控生物科技股份有限公司。 日本光电Mek7222 血细胞分析仪;日立7080 全自动生化分析仪。

1.3 实验方法

采用日本光电MEK-7222 K 血球分析仪测定22项血液生理指标,仪器精密度:WBC 2.0%,RBC 1.5%,HGB 1.5%,MCV 1.0%,PLT 4.0%。 生理测定项目分别为:白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白浓度(HGB)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞分布宽度(RDW)、白细胞五分类计数、平均血小板体积(MPV)、血小板压积(PCT)和血小板分布宽度(PDW)。

采用日立7080 全自动生化分析仪测定12 项血液生化指标:碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHO)、葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)、钙(CA)、磷(P)、总胆红素(Tbili)。

1.4 统计学方法

按照品种和性别分类整理数据,用SPSS 软件作独立样本t检验统计分析,结果均以平均数±标准差( ˉx ±s)表示。

2 结果

2.1 生理指标测定结果

转基因组与对照组在WBC、RBC、HGB、HCT、MCH、RDW、PLT、NEUT、LYM%、NEUT%这10 项指标中存在统计学差异(详见表1)。 其中,转基因组在WBC、RBC、HGB、HCT、NEUT、NEUT%这6 项指标上显著低于对照组(P＜0.01),在MCH、RDW、PLT 三项指标上也低于对照组(P＜0.05),在LYM%指标上显著高于对照组(P＜0.01)。

按照性别比较,转基因雌性组与对照雌性组在WBC、RBC、HGB、HCT、MCH、MCHC、RDW、PLT、PCT、NEUT、LYM 这11 项指标中存在差异(详见表2)。 其中,转基因雌性组在HCT、PCT、NEUT、LYM四项指标低于对照雌性组(P＜0.05),其余7 项指标上显著低于对照组雌性(P＜0.01)。 转基因雄性组与对照雄性组在转基因组在WBC、RBC、HGB、HCT、NEUT、NEUT%这6 项指标上显著低于对照组,在MCH、RDW、PLT 三项指标上也低于对照组(P＜0.05),在LYM%指标上显著高于对照组(P＜0.01)。 转基因雄性组与对照雄性组在WBC、RBC、HGB、HCT、LYM、NEUT、LYM%、NEUT%这8 项指标中存在差异。 其中,在RBC、HGB、HCT、NEUT、NEUT%五项指标中,转基因雄性组显著低于对照雄性组(P＜0.01),在WBC、LYM 两项指标中低于对照雄性组组(P＜0.05),而在LYM%指标上显著高于对照雄性组(P＜0.01)。

对同组进行组内比较,两组别雌雄间均有7 项指标存在差异。 转基因组雌雄在MCV、MCH、MCHC、RDW、PLT、NEUT、NEUT%存在统计学差异,对照组雌雄间在RBC、HCT、MCV、LYM、NEUT、LYM%、NEUT%存在统计学差异,详见表2。

表1hTIM4-EGFP与C57BL/6 血液生理指标的比较( ˉx ±s,n=18)Table 1 Comparison of blood physiological values ofhTIM4-EGFPand C57BL/6 mice注:与C57BL/6 小鼠比较,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01。Note. Compared with the C57BL/6 mice,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01.项目Items单位Unit 12 周龄hTIM4-EGFP 小鼠hTIM4-EGFP mice of 12-week-old 12 周龄C57BL/6 小鼠C57BL/6 mice of 12-week-old白细胞计数WBC 109/L 2.▲▲ 3.红细胞计数RBC 1012/L 8.▲▲ 9.血红蛋白HGB g/L 122.▲▲ 141.红细胞压积HCT % 36.▲▲ 41.平均红细胞体积MCV fL 25. 26.平均红细胞血红蛋白MCH Pg 8.▲ 9.血红蛋白浓度MCHC g/L 192. 205.平均红细胞分布宽度RDW % 7.▲ 7.血小板计数PLT 109/L 616.▲ 721.血小板压积PCT % 0. 0.平均血小板体积MPV fL 1. 1.血小板分布宽度PDW % 9. 10.淋巴细胞计数LYM 109/L 1. 2.单核细胞计数MON 109/L 0. 0.中性粒细胞计数NEUT 109/L 0.▲▲ 1.嗜酸性粒细胞计数EOS 109/L 0. 0.嗜碱性粒细胞计数BAS 109/L 0. 0.淋巴细胞百分比LYM% % 48.▲▲ 35.单核细胞百分比MON% % 0. 0.中性粒细胞百分比NEUT% % 8.▲▲ 23.嗜酸性粒细胞百分比EOS% % 0. 0.嗜碱性粒细胞百分比BAS% % 0. 0.