开展生化药物指纹图谱研究可行性探讨药学专论邹积宏1，邹积先2，刘红梅3，刘长海4，杨晶1，许莉1(1．黑龙江大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨；2．大庆职工医学院，黑龙江大庆；3．哈尔滨医科大学药学院，黑龙江哈尔滨；4．大连天宇制药有限公司，辽宁大连1161lO)摘要：生化药物取材于生物体，包括多肽、多糖、氨基酸等多种活性物质，为加强生化药物质量控制，制订出能鉴别真伪、评价优劣、监控质量稳定性及均一性的质量标准是关键。经科学评价的指纹图谱是目前能有效分析组分复杂的生物药物的先进手段。通过对指纹图谱进行基础性研究，建立科学的检测方法能全面系统地反映出药效组分的整体信息。生化药物指纹图谱研究涉及多学科，具有独创性和新颖性，并具有知识产权，对我国生化药物整体水平提高意义重大。关键词：生化药物；指纹图谱；质量控制；研究内容；研究程序中图分类号：TQ460．72文献标识码：A文章编号：1006—4931(2007)04—0025—03FeasibilityApproach toStudy onBiochemicalDrugFingerprintSpectrumZouJihongj，ZouJixian2，LiuHongmei3，LiuChanghai4，Y帆g】访g，XuLi÷(J．Life—sciem：eCollege ofHeilongfiangUniversity,Harbin,Heilongfiang,China}2．Medical staffCollege ofDaqing,Daqing,Heilongfiang,China曲3．College ofPharmacy,HarbinMedicalUniversity,Harbin,Heilongfiang,China4．DalianTianyuPharmaceuticalCa，nd，Dalian,Liaoning,China』161 lO)Abstract：The biochemical drug is obtained from the organism and contains amino acids，polypeptide，polysaccharides and other activity matters．In order to strengthen the quality control of biochemical drugs it is the key that the quality standard should be established for discriminating the fake medicines，evaluating drugs and monitoring the stability and homogenicity of product quality．Fingerprint spectrum is an advanced method analyzing complex componens effectively．Setting up scientific test methods by researching the fingerprint spectrum can reflect the total information of the effective constituents．Fingerprint spectrum of biochemical drug involves many subjects and has the originality，novelty with the independent intellectual property rights．This research is of important significance for increasing the whole level of biochemical drugs in our country．Key words：biochemical drug；fingerprint spectrum；quality control；study content；study procedure生化药物是从生物体或其代谢分泌产物中经分离、纯化获得的，是用于预防、治疗和诊断疾病的具有生化活性的基本物质，这类物质也可以用化学合成或现代生物技术制得，主要包括氨基酸、肽、蛋白质、酶及辅酶、多糖、脂质、核酸及其降解产物，它们均具有多种生物活性或生理功能”。2l。国外生化药物的研究经过几十年的发展，正逐渐朝着安全、规范化管理、精制纯化、高活性明晰成分的生物工程手段制备方向发展。我国虽然开展生化药物研究比较晚，但却是畜牧和饲养业大国，生化药原料综合利用成本比较低，国家对生化药物高度重视并实行优惠政策，故生化药物产业发展迅猛，研究和开发的生产品种非常之多，1998年以前就达几百种。尽管如此，目前生化药物在生产和质量管理方面还存在许多严重问题。1目前生化药物存在的问题1．1原材料缺乏严格的质量标；隹生化药物原料来源(如畜禽脏器)比较混乱。市场经济使饲养业多元化发展，肉用畜禽在统一屠宰方面问题多多，常规简单病害、病原体检疫很不正规，出现的事故触目惊心。畜禽脏器组织的质量存在严重隐患。肆虐全球的人畜共患疾病禽流感、疯牛疯^爿E典、口蹄疫已引起国际高度重视【3】。由于国家没有制订药用动物脏器的检验标准和项目，目前各生化药品生产厂对外购的畜禽脏器可以说是不进行任何检验检疫就直接加工生产，对肉用畜禽卫生检疫更不进行认证。另外现在饲养畜禽使用助长剂、兽药的现象比较普遍，散养猪、垃圾猪极为常见，动物体内特别是脏器中存在污染物、病原体14。5l，致使直接用于体内注射的生化药品的安全隐患非常严重。1．2生产工艺不规范目前国家药品标准收载的生化药物，特别是从脏器中提取的生化药物，多数都没有严格的原料质量标准，从取材、加工到成品生产都没有法定的工艺规范。特别是目前原料委托加工和半成品中国药业ChinaPharmaceuticals外购现象非常普遍，很难确保组分比较复杂的生化药物产品最终质量的均一性和可控性。另外对脏器加工、生产过程中的污染物(如重金属、有机溶剂残留等)的监控，对可能存在病原体的灭活等关键生产环节都存在许多问题，给生化药物的安全使用带来大量隐患…。1．3标准可控性不强现已升为国家标准并正在执行的生化药物质量标准，大多没有完全结合生化药物组成复杂的特点，还在遵循化学药质量标准，虽然借鉴了国外生化药物(脑活素、爱维治)的质量标准，但也仅是对主要药效组分(蛋白质、氨基酸、多糖等)进行粗略的定性和定量。例如，采用HPLC，SDS—PAGE等方法对蛋白质或多肽进行定性鉴别，仅能反映出主要标示药效成分的相似性，虽然也增没有活性指标检测项，但特异性都不强，不能给出全面反映多种有效成分功效特征的量化信息，不能真正鉴别真假、评价优劣。特别是用动物脏器生产的生化药物(例如胸腺肽注射剂)，组分中具有活性和功能的生化物质比较多，药效成分不是非常明确，受原料、辅料、试剂、工艺等因素的影响，组分往往会发生变化，直接影响临床疗效，导致毒副反应的发生。只有对原料的来源和品质进行严格控制，并对原料的加工工艺实行严格的标准，加强生产工艺的监控，对半成品进行严格检验，并规定具有特异性、准确性极高的详细而快捷的定性、定量检验项的成品质量标准，才能确保生化药产品的安全、有效1“。2生化药物指纹图谱研究的意义指纹图谱(fingerprint spectrum)是利用色谱或波谱技术获得的被测物质的特征性图谱，是一种综合和量化信息的鉴别手段，目前已广泛应用于生物化学、分子生物学、基因组学等研究领域。国外特别将指纹图谱应用于植物药物的标准当中，日本、美国、法国、德国等不仅将其用于植物药研究，还作为新药研究的重要指标进行·25·药学专论评审|71。我国对指纹图谱的研究也非常重视，国家食品药品监督管理局在2002年就明确规定所有申报中药注射剂的注册品种，必须申报相关的指纹图谱研究材料，其中包括中药原料、提取物、产品三方面的图谱，并且对图谱的相关性必须进行科学的对比分析，结果一致才有可能获得审批¨I。特别是取材于动物脏器的生化药物，如胸腺肽产品，原料须经过冷冻、提取、水解、纯化等加工过程，所得终产品的成分组成比较复杂，药理效应是所有活性成分综合作用的结果，因此比较适合采用能从整体性和模糊性方面进行比较的指纹图谱方法，以反映药物有效成分的特征性。该方法还能满足药物质量标准的专属性、重现性和实用性要求。在对生化药物原材料取材动物严格检疫、对所取脏器进行病原体检查，确保安全后对提取物和半成品、成品的成分相似性进行确认和监控，尤其是对不同批次、不同厂家的同品种的质量进行监控和评价，鉴别真伪和评判优劣方面，指纹图谱非常适合。另外，由于生化药物生产时原料提取的生产工艺对最终成品活性成分组成影响非常大，通过将指纹图谱纳入质量标准的检查项，加强质量标准的特异性和严格性，可直接规范产品的生产工艺标准，能有效确保产品质量的稳定性『9“4I。到目前为止，对于生化药物生产和质量控制，国内外还没有一种技术手段能够全面综合地反映出生化药物复杂质量差异的方法。国外指纹图谱在生理学、病理学以及动物脏器提取物方面已有了一些研究””。但发达国家药典在生化药物质量检测项中对指纹图谱也没有明确规定，指纹图谱在生化药物领域的研究还是空白。借鉴指纹图谱在植物药和中药研究中所取得的经验，将其应用于生化药物质量的研究和质量标准的规范中，从原料提取、中间体加工、成品质量稳定性进行严格监控，全面确保生化药物的质量，这些工作将具有国际创新性和独立知识产权，还将为我国生化药物的发展奠定理论基础。因此生化药物指纹图谱的研究是提高我国生化药物整体水平的关键，也是生化药物质量与国际接轨的重要举措。3生化药物指纹图谱的基础研究工作生化药物指纹图谱的研究和分析，涉及分析化学、生物化学、生物分离技术以及生理学、药理学、生物信息学等多学科的交叉和综合应用，研究工作量比较大。将指纹图谱应用于生化药物生产的质量控制，还是一个涉及许多生产质量管理问题的系统工程。在借鉴中药指纹图谱研究经验的同时，必须结合生化药物自身的特点确定含全部药效组分信息在内的整体质量特征的检测方法，前提是在生物活性和药理作用指导下进行有效成分分析和质量特征性研究，不是从某个化学成分的构效关系和分子药理学研究人手，而是从活性成分群或组的综合角度考虑，同时不局限于组分表面上的理化性质研究，而要科学合理地对药效组分特征性进行标准化规定。完善相关的基础研究工作是开展生化药物指纹图谱研究的关键和前提。-1)生化药物指纹图谱的测试主要包括以下研究：研究样品(成品及原料提取液)有效成分的提取与分离方法并进行科学规范的评价；波谱、色谱检测和分离条件优化研究；生化药物中活性成分分析和鉴别；多联用分析新技术的方法学研究及其规范化；生产工艺与有效成分的相关性研究；生化药物指纹图谱分析方法的初步确定。2)生化药物指纹图谱的鉴别方法主要包括以下研究：生化药物指纹图谱特征信息的提取方法研究；同一种分析方法、不同检测方式以及不同分析方法检测的多样品和多信息的数据相关性研究，如投影法、向量夹角余弦法、相·26·2007年第16卷第4期关系数法等；生化药物指纹图谱相似度计算方法研究和计算机基础数据处理程序编制；生化药物质量图谱快速处理方法的验证；建立生化药物综合的指纹图谱计算方法体系。3)生化药物药效组分药理活性的检测方法学研究针对不同生化药物药理和生物活性的文献报道及临床适应症，开展从机体、器官、组织、细胞和分子生物学等不同层面和水平的药理学研究，筛选出能够反映主要药效并具有快速、准确、样品用量小的活性检验指标和方法，在此基础上确定稳定的药效组分群，并建立规范的指纹图谱。主要包括：药效组分药理作用和生物活性的体内外检测方法研究，如靶细胞的培养和模型的建立；药效组分生物活性和药理指标的仪器测试及检测条件研究；以活性指标为手段的生化药物药效组分快速筛选方法研究；多组分、多功能生化药物不同活性检测指标的方法学研究。4)生化药物指纹图谱的组分药效学研究在化学指纹图谱、药效成分和药效活性已确定的基础上，充分利用现代信息学的研究成果，开展以胸腺肽注射剂型产品为先导的指纹图谱信息与药效活性成分的相关性研究。由单一的化学比对式分析向生化药物药效指纹图谱方向发展，从而建立生化药物的研究体系和质量分析平台．为全面开展生化药物的质量研究和应用提供理论和技术支持。5)生化药物指纹图谱的控制将研究确定的指纹图谱，根据不同生化药物的工艺质量特点，应用于原料提取、半成品加工的质量控制，以及最终产品的质量评价及稳定性考察。包括：原料提取液指纹图谱的质量控制；通过对半成品和中问体指纹图谱的监控，以及对成品的质量评价和稳定性考察，确立对生化药物生产全过程的质量控制方法；通过对生化药物指纹图谱的思维模式构建，为将来指导创新药物的开发进行探索性研究。4生化药物指纹图谱研究程序的构想为了使研究指纹图谱的工作顺利开展，研究初期最好选定临床常用的、生产量比较大的、具有代表性的生化药物品种(如胸腺肽)。首先，应全面考察评价不同厂家、不同批次的产品质量；其次，从临床药效、药理活性检测和生物信息处理三方面进行综合考虑，运用包括色谱、波谱以及多维联用的分析技术，总结出规范的、有实际应用价值的指纹图谱分析方法，并以此为模式，遵循一定的程序搭建生化药物质量研究的技术平台；第三，扩大指纹图谱在生化药物领域内的应用范围，根据不同品种的特点，应用于原料取材、提取液和半成品加工的质量控制，以及成品的质量评价和稳定性考察。1)品种的确定：为了减少在药效组分方面研究工作的盲目性，应有针对性地选择临床用量比较大、疗效比较确定、成分比较复杂，并已被国家药品标准收载的重点生化药物作为指纹图谱的研究对象。2)样品的收集：目前临床常用的生化药物(如胸腺肽注射剂)，生产厂家多达几十家。为保证样品的整体性、可代表性，选择厂家不应少于10个，并应考虑厂家的分布区域，每个厂家的产品不少于3批，要重点研究其质量共性和特异性，并确定特异性的药理活性考察指标，进行质量综合评价，进一步分析确定药效组成成分存在的问题及其与工艺的相关性。3)检测样品的确定：为使考察的生化药物样品检验结果具有真实性、综合性，检测样品应尽可能用药品原液，为了排除干扰因素，应对样品进行适当的前处理，以确保检测数据能反映出样品药中国药业ChinaPharmaceuticals